для чего используется иммерсионная микроскопия в бактериологии

Глава 2 МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Световая микроскопия

Для обнаружения и исследования микроорганизмов приме­няют микроскопы.

Световые микроскопы предназначены для изучения микро­организмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т.п.), а электронные – для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бак­терий. Современные световые микроскопы – это сложные оп­тические приборы, обращение с которыми требует определен­ных знаний, навыков и большой аккуратности.

Световые микроскопы подразделяются на студенческие, ра­бочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микро­скопы («Биолам», «Бимам», «Микмед») имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С – студенческие, Р – рабочие, Л– лабораторные, И – исследовательские), ком­плектация обозначается цифрой, например МБР-1, МБИ-3.

В микроскопе различают механическую и оптическую час­ти (рис. 2.1).

а – общий вид микроскопа «Биолам»; б – микроскоп МБР-1: 1 – основание микроскопа; 2 – предметный столик; 3 – винты для перемещения предметно­го столика; 4 – клеммы, прижимающие препарат; 5 – конденсор; 6 – крон­штейн конденсора; 7 – винт, укрепляющий конденсор в гильзе; 8 – рукоятка перемещения конденсора; 9 – рукоятка ирисовой диафрагмы; 10 – зеркало; 11 – тубусодержатель; 12 – рукоятка макрометрического винта; 13 – рукоятка микрометрического винта; 14 – револьвер объектива; 15 – объективы; 16 – наклонный тубус; 17 – винт для крепления тубуса; 18 – окуляр.

К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конден­сора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микроме­ханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конден­сора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую стороны, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввин­чиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через кото­рый наблюдают изображение, устанавливают с противополож­ной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

Основную роль в получении изображения играет объектив, формирующий увеличенное действительное и перевернутое изо­бражение объекта, которое затем дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, дающий аналогично обычной лупе увеличенно мнимое изображение (рис. 2.2).

Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изо­бражения, его четкость определяется разрешающей способнос­тью микроскопа, т.е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел разрешения – минималь­ное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно, – зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура в свою оче­редь зависит от угловой апертуры объектива и показателя пре­ломления среды, находящейся между фронтальной линзой объ­ектива и препаратом. Угловая апертура – это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и пре­паратом, к показателю преломления стекла, тем выше разре­шающая способность объектива. Если считать апертуру кон­денсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:

Рис. 2.2. Ход лучей в микро­скопе с настройкой освещения по Кёлеру.

а – принципиальная схема микроскопа и осветительной системы: 1 – источник света; 2 – коллектор; 3 – полевая диафрагма осветителя; 4 – зеркало; 5 – апертурная диафрагма конденсора; 6 – конденсор; 7 – препарат; Т – увеличенное действительное промежуточное изображение, образуемое объективом; 7 – увеличенное мнимое окончательное изображение, наблюдаемое в окуляр; 8 – объектив; 9 – выходной зрачок объектива; 10 – полевая диафрагма окуляра; 11–окуляр; 12 – глаз;

б – принцип освещения по Кёлеру: 1 – источник света; 2 – коллектор; 3 – полевая диафрагма; 4 – светофильтр; 5 – апертурная диафрагма; 6 – конденсор; 7 – объект; 8 – объектив

где R – предел разрешения; λ – длина волны; NA– числовая апертура.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное уве­личение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличен­ной в 500–1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.

В зависимости от среды, которая находится между объекти­вом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до х40) и иммерсионные с максимальны­ми апертурой и увеличением (х90–100). «Сухой» объектив – это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом находится воздух.

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую такой же по­казатель преломления, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллирован­ную воду, а для объективов масляной иммерсии – кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируют­ся, и оно, в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя поль­зоваться суррогатами иммерсионного масла, в частности вазе­линовым маслом.

Изображение, полученное с помощью линз, имеет недостат­ки: сферические и хроматические аберрации, кривизну поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков разли­чают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Со­ответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, получен­ное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО – апохромат и т.п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объектив масляной иммерсии – обозначение МИ и черное кольцо.

Все объективы рассчитаны на работу с покровным стеклом толщиной 0,17 мм. Толщина покровного стекла особенно вли­яет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (х40). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм, потому что толщина покровного стекла может оказаться боль­ше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае при попытке сфокусировать объектив на препарат может быть по­вреждена фронтальная линза объектива.

После окончания настройки света по Кёлеру нельзя изменять положение конденсора, раскрытие полевой и апертурной диа­фрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата.

Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное – к значительному ухудшению качества изобра­жения (появлению дифракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на 1 /₃— Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до х10) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.

Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение, – с сильными сухими (х40) и иммерсионными (х90) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбо­ку, опускают объектив макровинтом почти до соприкоснове­ние с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Уход за микроскопом. При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверх­ности линз, зеркал и светофильтров.

Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла по­лотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чис­тым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов кси­лолом, так как это может привести к их расклеиванию.

С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нель­зя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы – это приведет к их порче. По окончании работы с микроскопом необходимо тщательно удалить остатки иммер­сионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом, затем опустить предметный столик (или кон­денсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.

Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо пе­риодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитан­ной бескислотным вазелином, и затем сухой мягкой чистой тряпкой.

Помимо обычной световой микроскопии, существуют ме­тоды микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные мик­роорганизмы: фазово-контрастная, темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа, используют электронную микроскопию.

Источник

Микроскопия микробиологических препаратов.

Апекслаб, ООО Лабораторное оборудование и материалы

Микроскопическое исследование клинических образцов (мокроты, гноя, отделяемого из ран, ликвора и пр.) является важным этапом микробиологического анализа, позволяющим получить предварительные данные о качественном и количественном составе микрофлоры в патологическом матери­але, а также оценить соответствие материала очагу воспаления. Иногда микроскопия помогает выявить микробы, не растущие на обычных питательных средах.

Микроскопия мазков из чистых культур бактерий позволяет определить их морфологию, что наряду с окраской по Граму является важным ориентиром в выборе направления последующей их идентификации.

При изучении микробиологических объектов чаще используют световую микроскопию окрашенных препаратов под иммерсией (объектив х 90).

При микроскопии в темном поле эффект создается при помощи специального конденсора-параболоида или обычного конденсора с прикрытой кружком черной бумаги центральной частью, а объект кажется светящимся на фоне темного поля зрения. Препарат готовят по типу раздавленной или висячей капли; применяется для индикации спирохет, боррелий, лептоспир.

Фазово-контрастная микроскопия может использоваться для изучения без предварительной обработки бесцветных, прозрачных объектов (живых клеток, срезов тканей и т.п.), детали строения которых оптически мало различаются между собой. Суть метода заключается в том, что с помощью специального устройства конденсора и объектива разность фазовых колебаний, проходящих через биологический объект и окружающую среду световых волн, недоступных человеческому глазу, преобразует­ся в разность интенсивностей (амплитуд) света, благодаря чему детали строения объекта становятся видимыми. Метод аноптральной микроскопии является дальнейшим развитием метода фазового контраста (в его основе сохраняется тот же принцип) и отличается большей разрешающей способностью объективов и возможностью выявления минимальных оптических разностей плотности в неокрашенных препаратах.

Люминесцентная микроскопия позволяет получить цветное изображение самосветящихся объектов на черном фоне свысокой степенью их контрастности с помощью люминесцентного микроскопа. Она основана на явлении флюоресценции (или люминесценции), когда некоторые вещества под влиянием падающего на них света испускают лучи с другой (обычно большей) длиной волны. Поэтому вещества, имеющие определен­ный цвет при обычном освещении, при освещении ультрафиоле­товыми лучами приобретают совершенно иную окраску. Объект, не видимый в ультрафиолетовом свете, может пробрести яркий блеск после обработки его флюоресцирующим веществом (флюорохромом). В таком препарате сила свечения объектов бывает различной, но чаще всего она невелика, поэтому люминесцентную микроскопию следует проводить в затемненном помещении. В зависимости от используемого флюорохрома применяют строго определенный набор светофильтров. Важно ис­пользовать специальное нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

Для обнаружения и идентификации бактериальных антигенов ис­пользуют меченые флюорохромом иммунные сыворотки в реакциях прямой и непрямой иммунофлюоресценции.

Приготовление препаратов для микроскопии

От качества приготовления препарата во многом зависит ре­зультат микроскопии.

Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Это достигается разными способами, из которых наиболее доступны нижеследующие:

• стекла кипятят 15 мин в 1% растворе соды (или в мыльной воде), споласкивают водой, помещают в слабую соляную кислоту и, наконец, хорошо промывают водой;

• стекла обрабатывают жидкостью следующего состава: калия бихромат 20 г, серная кислота (техническая) 20 г, вода 200 мл; после 20 минут кипячения в этой смеси промывают стекло водой, а затем спиртом. Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси рав­ных количеств спирта и эфира, или в 96° спирте, или промытыми и вытертыми досуха.

Микроорганизмы можно исследовать в живом состоянии ив окрашенных препаратах.

а) Исследование микроорганизмов в живом состоянии про­водят для изучения формы и подвижности бактерий либо ввисячей, либо в раздавленной капле.

Для висячей капли необходимо иметь специальное предметное стекло с луночкой. Маленькую капельку бульонной культуры наносят на покровное стекло; если исследуют агаровую культуру, то на покровное стекло предварительно наносят небольшую каплю воды или физиологического раствора, куда затем вносят петлей незначительное количество бактерий и размешивают их. Можно заранее приготовить взвесь культуры в физиологическом растворе и взять капельку из нее. И в том, и в другом случае на покровное стекло накладывают предметное стекло так, чтобы капля оказалась в луночке, края которой предварительно смазы­вают вазелином. Стерла слегка прижимают друг кдругу, в резуль­тате чего они склеиваются, образуя герметически закрытую камеру, в которой капля долго не высыхает. Препарат микроскопируют покровным стеклом кверху.

Для раздавленной капли пользуются простым предметным стеклом, куда наносят материал (физиологический раствор и культуру), накрывая его покровным стеклом. Капельки нужно брать такой величины, чтобы они заполняли все пространство между стеклами и не выступали за края покровного (избыток материала удаляют фильтровальной бумагой). Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Для микроскопии лучше использовать фазово-контрастную или ант-ропольную установку.

б) Исследование окрашенных препаратов позволяет не толь­ко изучить морфологию бактерий, но и судить о некоторых деталях их химического строения, что достигается применением специальных красок.

Для приготовления препаратов из жидких культур каплю мате­риала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде берут петлей ничтожное количество и раз­мешивают в заранее нанесенной на стекло капле воды или физиологического раствора, размазывая по стеклу до диаметра мазка 1,5-2 см. Мазок высушивают на воздухе, затем его фиксируют (в этом случае мазок будет хорошо держаться на стекле, а убитые бактерии лучше воспринимают окраску). Самый простой и распространенный способ — фиксация жаром. Держа стекло мазком вверх, его трижды проводят через пламя газовой или спиртовой горелки (время фиксации не должно превышать 5-6 сек, а время прямого воздействия пламени — 2 сек). Во избежание перегрева препарата контролем может служить прикосновение стекла к тыльной поверхности ладони (должно быть ощущение легко переносимого жжения). Для фиксации можно использовать химические вещества: этиловый 95° спирт (время фиксации 10-15 мин), метиловый спирт (2-3 мин), ацетон (5 мин), смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира по Никифорову (10-15 мин) и др.)

Источник

Методы микроскопии

Определение понятия

Микроскопические методы исследования – это способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических и других исследованиях.

Микроскоп – это оптический прибор, имеющий как минимум двухступенчатое увеличение. И одно из них принадлежит окуляру, который играет роль лупы. Только в отличие от бытовой лупы, окуляр имеет постоянное увеличение, его положение в микроскопе определено и жестко закреплено стандартом (высота окуляра).

Любой оптический микроскоп имеет базовые узлы, функциональное назначение которых не меняется от типа, класса прибора или страны производителя. Разница только в конструкторском и технологическом решениях, предложенных специалистами фирм-разработчиков, а также уровне мирового научно-технического прогресса. И как бы микроскоп не назывался – световой, цифровой, видеомикроскоп, фотомикроскоп, лазерный сканирующий микроскоп, анализатор изображения – в его основе будет базовый световой микроскоп, принцип которого был разработан еще Левингуком, Ньютоном, Карл Цейсом, Эрнстом Аббе.

Микроскоп – это оптико-механо-электрический прибор, объединяющий в себе три функциональные части:
· функция воспроизводящей системы – воспроизвести (создать, сформировать) изображение объекта таким образом, чтобы оно как можно точнее передавало детали объекта с соответствующим разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей;
· функция визуализирующей системы – передать изображение объекта, созданное воспроизводящей системой микроскопа, таким образом, чтобы оно с небольшим дополнительным увеличением (или без него) было видно достаточно резко на сетчатке глаза, фотопленке или пластинке, на экране телевизора или монитора компьютера;
· функция осветительной системы – создать световой поток, позволяющий осветить объект таким образом, чтобы воспроизводящая система микроскопа предельно точно могла выполнить свою основную функцию. При этом совместная работа обоих систем должна обеспечивать визуализацию изображения с использованием физико-химических свойств объекта.

Важнейшей характеристикой каждого объектива микроскопа является его разрешающая способность. Разрешающей способностью называется расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно (т.е. не сливаются в одну).

Для полного использования разрешающей способности иммерсионного объектива необходимо выполнять следующие основные правила:
1) Конденсор осветительного аппарата должен быть поднят до отказа (до уровня предметного столика).
2) Диафрагма конденсора полностью открыта.

Во всех без исключения случаях работа ведется с применением встроенной подсветки или плоского зеркала, так как конденсор рассчитан на работу с параллельными пучками света.
Одной из важных характеристик объектива является его свободное рабочее расстояние, т.е. расстояние между верхней поверхностью препарата и нижней поверхностью фронтальной линзы объектива при наведенном на фокус объективе. Эти расстояния следующие:
для объектива с увеличением 10х – 0,25 мм;
для объектива с увеличением 40х – 0,65 мм;
для объектива с увеличением 100х – 1,25 мм.
Знание этих расстояний необходимо для того, чтобы быстро сфокусировать объектив на препарат.

Порядок работы со световыми микроскопами
· Проверить состояние осветительного аппарата: поднять конденсор, открыть его диафрагму, включить питание и для установки интенсивности освещения медленно повернуть ручку настройки яркости, в случае отсутствия встроенной подсветки, поставить плоское зеркало.
· Поместить на столик микроскопа исследуемый препарат и установить в фокусе сухой объектив (10х) на расстояние несколько меньше свободного рабочего расстояния.
· Глядя в окуляр, произвести предварительную установку освещения с помощью ручки настройки яркости (или вращая зеркалом).
· Медленно поднимая тубус макровинтом, добиться резкого изображения препарата.
· Поставив сухой (40х) или иммерсионный (100х) объектив, опускать тубус микроскопа под контролем глаза, глядя сбоку. Опустить объектив на расстояние меньше свободного рабочего и, глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до тех пор, пока не появится мелькание препарата. Точная установка достигается с помощью микровинта. Не следует делать микровинтом более половины оборота в одну или другую сторону.

Микроскопия неокрашенных объектов
При работе с нативным материалом необходимо соблюдать два основных принципа: не загрязнить исследуемый объект микроорганизмами, не заразить себя и окружающую среду. При микроскопии необходимо помнить, что рассматривание неокрашенного препарата возможно только с ограниченным освещением, путем опускания конденсора или уменьшением отверстия ирис-диафрагмы. Для микроскопии неокрашенных объектов используется окуляр 10х и объектив 10х.
При освещении с помощью встроенной подсветки осветителя или плоского зеркала ирис-диафрагма частично закрыта, конденсор опущен. С помощью макровинта устанавливается поле зрения и проводится обзор препарата. С целью обнаружения объекта все нативные (неокрашенные) препараты просматривают под малым увеличением с помощью макровинта. Для лучшего рассмотрения объекта или его отдельных фрагментов используется сухой объектив с увеличением 40х и освещенность, с помощью поднятия конденсора и открытия ирис-диафрагмы под контролем глаза.

Микроскопия окрашенных объектов
При микроскопии окрашенного препарата необходимо помнить, что рассматривание возможно только при полном освещении. Для микроскопии окрашенных объектов используется окуляр 10х и объектив 10х.
Ирис-диафрагма открыта, конденсор поднят. С помощью макровинта устанавливается поле зрения и проводится обзор препарата. Достигается максимальное освещение препарата. При малом увеличении делается обзор препарата для обнаружения четко выраженных полей зрения. Изучение препарата проводится под большим увеличением с применением сухой системы объектив 40х. Для микроскопии окрашенных препаратов биологической жидкости, мокроты, биологического материала применяется иммерсионная система объектив 100х с нанесением на предметное стекло иммерсионного масла.

Общий метод: наблюдение. Частный метод: микроскопирование.

Christine E. Farrar, Zac H. Forsman, Ruth D. Gates, Jo-Ann C. Leong, and Robert J. Toonen, Hawai’i Institute of Marine Biology at the University of Hawai’i, Manoa

No dyes or digital software produced the brilliant color of these corals—the glory is all their own. Fluorescent molecules, innate to the corals and to the red algae that live inside and nourish them, shine like Christmas lights under different wavelengths of light emitted by a confocal microscope.

When she saw the corals under the lens for the first time, «my jaw just dropped,» says Ruth Gates, a coral biologist at the University of Hawai’i, Manoa, and the narrator of the video. «Most people think corals are inanimate rocks,» she says. «We showcase how beautiful and dynamic they are as animals.» In the video, which compiles the images into three-dimensional, time-lapse animations, corals extend and retract their glowing tentacles. Tiny creatures crawl over the corals, all part of a complex and threatened ecosystem. In the future, Gates says, it might be possible to use confocal microscopy to classify different coral species or diagnose coral disease by their fluorescent patterns. Prior to applying this technique, she says, «that was not even a facet in our thinking about coral biology.»

Источник