для чего в лимфатических сосудах имеются клапаны
Для чего в лимфатических сосудах имеются клапаны
Лимфатическая система проводит лимфу от тканей в венозное русло. Начинается она лимфокапиллярами, которые представляют собой слепо начинающиеся уплощенные канальцы. Стенка их образована только эндотелием. Базальной мембраны и перицитов нет (в отличие от кровеносных капилляров). Эндотелий лимфатических капилляров связан с окружающей соединительной тканью пучками якорных, или стропных, филаментов, препятствующих спадению капилляров.
Между эндотелиоцитами имеются щели. Диаметр лимфатических капилляров (20-30 мкм) может изменяться в зависимости от степени наполнения их лимфой. Лимфокапилляры в виде сети пронизывают все органы и ткани, за исключением мозга, глазного яблока, внутреннего уха, печеночных долек, лимфоидной ткани селезенки, лимфатических узлов, миндалин, костного мозга, аденогипофиза, плаценты и некоторых других органов.
Лимфатические капилляры выполняют дренажную функцию, участвуя в процессах всасывания фильтрата плазмы крови из соединительной ткани. На поверхности эндотелиоцитов, обращенной в сторону интерстициальной соединительной ткани, присутствуют микровыросты, а транспортные пиноцитозные везикулы направлены в сторону просвета капилляра.
Через так называемый посткапиллярный отдел (который отличается от лимфокапилляров наличием клапанов) лимфатические капилляры постепенно переходят в лимфатические сосуды малого, среднего и крупного калибров. В структуре стенки лимфатических сосудов много общего с венами, что объясняется сходными условиями лимфо- и гемодинамики (низкое давление, малая скорость протекания, направление тока от тканей к сердцу).
Различают лимфатические сосуды мышечного и безмыгиечного типов. Средние и крупные лимфатические сосуды имеют в составе стенки три хорошо развитые оболочки (внутреннюю, среднюю и наружную). Внутренняя облочка лимфатических сосудов образует многочисленные складки — клапаны. Расширенные участки лимфатических сосудов между соседними клапанами называются лимфангионами.
Средняя оболочка более выражена в сосудах нижних конечностей. По ходу лимфатических сосудов расположены лимфатические узлы. Протекая через них, лимфа обогащается лимфоцитами. Особенностью строения стенки крупных лимфатических сосудов (грудного протока и правого лимфатического протока) является хорошо развитая наружная оболочка, которая в 3-4 раза толще внутренней и средней оболочек вместе взятых. В наружной оболочке проходят продольные пучки гладкомышечных клеток. По ходу грудного протока имеется до 9 полулунных клапанов.
Иннервация сосудов. Вегетативные нервные волокна сопровождают сосуды, заканчиваясь на их стенке рецепторами и эффекторами. Чувствительные нервные окончания отличаются многообразием форм и большой протяженностью, залегая во всех трех оболочках сосудов. Эффекторные нервные волокна заканчиваются на гладких мышечных клетках сосудов нервно-мышечными синапсами.
Возрастные изменения сосудов. В течение всей жизни происходит непрерывная перестройка сосудистой системы в связи с изменением условий их функционирования. С возрастом стенка сосудов уплотняется вследствие разрастания соединительнотканных структур, атрофии клеток средней оболочки и появления известковых отложений. При нарушении структурной целостности тканей внутренней оболочки сосудов (эндотелия, рыхлой волокнистой соединительной ткани) и изменении их метаболизма возможно развитие атеросклероза.
При этом во внутренней оболочке сосудов происходит накопление холестерина и образование атеросклеротических бляшек. Подобные изменения в венечных (коронарных) артериях приводят к ишемической болезни сердца. С возрастом нередко наблюдаются изменения стенки вен и лимфатических сосудов, приводящие к их варикозным расширениям.
Регенерация сосудов. Рост и регенерация капилляров происходят за счет образования эндотелиальных выпячиваний в виде почек по принципу «эндотелий от эндотелия» и формирования внутри этих выростов полости с протекающей в ней кровью. При ранениях стенки кровеносных сосудов (огнестрельные раны, действие ударной волны, сдавления, перегрузки и др. факторы) посттравматический гистогенез приводит к неполноценной регенерации эндотелия, волокнистой и гладкомышечной тканей оболочки сосудов, нарушению межтканевых корреляций в области дефекта стенки, замещению его, в основном, соединительной тканью, что способствует образованию посттравматических аневризм, а также к заращению просвета магистральных сосудов.
Для чего в лимфатических сосудах имеются клапаны
Функциональная анатомия лимфатических узлов (ЛУ) уже давно находится в центре внимания исследователей лимфатической системы [2–5, 7]. Взаимосвязи ЛУ и лимфатических сосудов придается большое значение в лимфологии [1, 3, 4, 6] и иммуноморфологии [14, 15]. Однако в литературе очень трудно найти фотографии с первыми клапанами эфферентных лимфатических сосудов каких-либо ЛУ, к тому же в связи с синусами ЛУ. Ранее я показал такие фотографии с гистологических срезов подколенного ЛУ кролика [10] и тотальных препаратов подвздошного ЛУ белой крысы [11] при обсуждении функциональной морфологии ЛУ и лимфатических сосудов. Я не нашел в литературе подробного описания топографии первых клапанов эфферентных лимфатических сосудов любых ЛУ. Между тем сосудисто-узловые соединения лимфатического русла в воротах ЛУ напоминают конструкцию и топографию начального отдела грудного протока при обнаружении цистерны. Она спаяна с поясничной ножкой диафрагмы, с чем связывают значительное локальное расширение протока. Его собственные клапаны над цистерной располагаются чаще. Начальные отрезки эфферентных лимфатических сосудов ЛУ тесно связаны с хиларной частью капсулы ЛУ, которая утолщена. В воротах ЛУ клапаны размещаются чаще, чем на удалении от него. Цистерне грудного протока соответствует воротный синус ЛУ по относительным размерам, а сложная сеть краевого и промежуточных синусов ЛУ по ее конструкции – сплетению поясничных стволов в основании цистерны [10, 12, 13].
Цель исследования: показать синусы ЛУ как истоки эфферентных лимфатических сосудов ЛУ и пространственные взаимоотношения их первых клапанов с синусами ЛУ.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на 5 белых крысах 2–3 мес обоего пола. Их центральные краниальные брыжеечные ЛУ вырезали с участком окружающей брыжейки, фиксировали в жидкости Буэна и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5–7 мкм, проведенные продольно через ворота ЛУ в их плоскости, окрашивали пикрофуксином по Ван Гизон.
Результаты исследования и их обсуждение
Ворота брыжеечного ЛУ, воронкообразно сужаясь, вдаются в вещество ЛУ на разную глубину. В толще ЛУ ворота имеют вид более или менее продольной щели, в которой определяется довольно компактный сосудистый пучок. В его составе определяются чаще всего артерия, 2 вены и 2–3 эфферентных лимфатических сосуда с более или менее прямолинейным ходом. Корни каждого из них выходят из воротного синуса ЛУ в виде его дивертикулов, сближающихся и чаще сужающихся в направлении первого клапана эфферентного лимфатического сосуда ЛУ. Каждый лимфатический сосуд может иметь 2–3 таких корня, причем корни данного лимфатического сосуда обычно отделены от корней соседних лимфатических сосудов венами. Первый клапан эфферентного лимфатического сосуда ЛУ всегда отставлен от места соединения его корней, т.е. находится уже на протяжении начального отрезка лимфатического сосуда, более широкого, чем любой из его корней. В глубокой, щелевидной части ворот ЛУ обычно определяются 2 клапана в эфферентном лимфатическом сосуде. Они имеют две длинные извитые створки. Первые межклапанные сегменты эфферентных лимфатических сосудов чередуются с венами, между ними вклинивается артерия. Сеть мозговых синусов окружает основание (дистальный отдел) воротного синуса ЛУ. Более или менее узкие каналы соединяют мозговые синусы с воротным синусом и корнями эфферентных лимфатических сосудов, а местами – и с первыми межклапанными сегментами лимфатических сосудов на их протяжении. Синусы ЛУ имеют очень тонкую эндотелиальную выстилку. Она заметно утолщается уже в корнях эфферентных лимфатических сосудов (рис. 1–4), в их стенках определяются миоциты. В широкой части ворот брыжеечного ЛУ сосудистый пучок разрыхляется, эфферентные лимфатические сосуды приобретают более извитой ход и часто расширяются в разной степени (возможно из-за снижения плотности окружения). Третий клапан эфферентного лимфатического сосуда размещается в области расширения хиларной воронки ЛУ.
Рис. 1. Брыжеечный лимфоузел крысы, продольный срез: 1 – мозговые синусы; 2 – воротный синус; 3 – первый клапан эфферентного лимфатического сосуда; 4, 5 – воротные вены. Пикрофуксин. Ув.: А – 50; Б – 120
Рис. 2. Брыжеечный лимфоузел крысы, продольный срез: 1 – мозговые синусы; 2 – воротный синус; 3 – первый клапан эфферентного лимфатического сосуда; 4, 5 – воротные вены. Пикрофуксин. Ув. 50
Рис. 3. Брыжеечный лимфоузел крысы, продольный срез: 1 – мозговые синусы; 2 – фрагмент воротного синуса; 3 – первые клапаны в начале эфферентных лимфатических сосудов. Пикрофуксин. Ув. 50
Рис. 4. Брыжеечный лимфоузел крысы, продольный срез: 1, 2 – первые два клапана эфферентного лимфатического сосуда; 3 – приток его первого межклапанного сегмента из мозговых синусов; 4,5 – воротные вены и артерия. Пикрофуксин. Ув. 50
Ранее я кратко описал истоки эфферентных лимфатических сосудов в подколенном ЛУ кролика [10]. Воротный синус этого ЛУ разделяется на ветви – эфферентные лимфатические сосуды. Они в 1,5–2 раза шире рядом расположенных вен внутри ЛУ, но сужаются в проксимальном направлении и становятся тоньше вен за пределами ЛУ. В подколенном ЛУ кролика, гораздо более коротком, чем изученный брыжеечный ЛУ крысы, явно короче ворота ЛУ и начальный, интрахиларный отрезок его эфферентного лимфатического сосуда. Однако в обоих случаях первые его 2 клапана, а следовательно и его первый межклапанный сегмент (лимфангион) находятся в узкой глубокой части ворот ЛУ, хотя указанные сегменты и сосуда, и ворот ЛУ заметно короче в подколенном ЛУ. В предыдущей работе [10] я отметил, что сосудисто-узловые соединения лимфатических путей в воротах подколенного ЛУ напоминают конструкцию и топографию начального отдела грудного протока при обнаружении его собственной цистерны. Она спаяна с поясничной ножкой диафрагмы, что обусловливает значительное локальное расширение протока. Над цистерной грудного протока чаще располагаются его собственные клапаны [11]. Описанные начальные отрезки эфферентных лимфатических сосудов подколенного ЛУ тесно связаны с хиларной частью его капсулы, которая утолщена. В начальных отрезках эфферентных лимфатических сосудов ЛУ клапаны размещаются чаще, чем на удалении от него. Цистерне грудного протока соответствует воротный синус ЛУ, а сложная сеть его краевого и промежуточных синусов – сплетению поясничных стволов, которое часто окружает основание цистерны. Капсула ЛУ и ее трабекулы содержат гладкие миоциты, которые при сокращении активно регулируют ширину просвета синусов ЛУ подобно, вероятно, влиянию диафрагмы на начало грудного протока. Клапаны подколенного ЛУ я обнаружил на границе между его воротным синусом и лимфатическими сосудами.
Заключение
Корни каждого эфферентного лимфатичеcкого сосуда брыжеечного ЛУ белой крысы представляют собой дивертикулы воротного синуса такого ЛУ и могут рассматриваться как предклапанные сегменты его эфферентного лимфатичеcкого сосуда. Первый межклапанный сегмент эфферентного лимфатического сосуда находится в узкой глубокой части ворот ЛУ. Предклапанные и, в меньшей мере, первый межклапанный сегменты эфферентного лимфатического сосуда принимают мозговые синусы ЛУ. Распределение первых 3 клапанов в эфферентных лимфатических сосудах удлиненного брыжеечного ЛУ эллипсоидной формы у белой крысы в принципе соответствует таковому размещению первых клапанов в эфферентных лимфатических сосудах более короткого подколенного ЛУ овальной формы у кролика, которое было показано мной ранее на рис. 7 [10]. Различие состоит в том, что при глубоком внедрении узкой части ворот в толщу брыжеечного ЛУ первые 2 клапана его эфферентного лимфатического сосуда располагаются на большем удалении друг от друга, чем в подколенном ЛУ, и его протяженный первый межклапанный сегмент явно получает в качестве притоков мозговые синусы. В любом случае только первый, пограничный клапан в воротах ЛУ относится к ЛУ и одновременно к его эфферентному лимфатическому сосуду. Этот клапан разделяет полости воротного синуса ЛУ и его эфферентного лимфатического сосуда, находится таким образом на выходе нодального лимфангиона с лимфоидной тканью в его стенках [10, 11]. Мозговые синусы, впадающие в первый межклапанный сегмент эфферентного лимфатического сосуда, я рассматриваю как его анастомозы с глубокой частью нодального синуса, коллатеральные воротному синусу ЛУ. Их можно сопоставить с исходящими из подвздошных ЛУ редкими (7,5 % случаев) коллатералями поясничных стволов и начала грудного протока человека [16].
В воротах подколенного ЛУ короткий первый межклапанный сегмент его эфферентного лимфатического сосуда напоминает цистерну конусовидной формы в начале грудного протока. Длинный первый межклапанный сегмент эфферентного лимфатического сосуда в воротах брыжеечного ЛУ можно сравнить только с очень узкой цистерной веретеновидной или узкой удлиненной цистерной ампуловидной формы. Поскольку в состав интрахиларного отрезка эфферентного лимфатического сосуда входят 2–3 межклапанных сегмента, то его можно сравнить с четковидной цистерной грудного протока. Хиларное утолщение капсулы ЛУ с мышечными пучками в отношении начала эфферентного лимфатического сосуда можно рассматривать как гомолог поясничной части диафрагмы вокруг начала грудного протока в плане формирования пассивного лимфатического сердца по A. Haller (1765) – Г.М. Иосифову (1930) [10]. Однако такую, данную мной ранее [10] оценку сравнительной анатомии лимфатического русла в начале грудного протока и в воротах ЛУ представленные в этой статье материалы вынуждают пересмотреть. Формально расширение лимфатического русла в области воротного синуса ЛУ совпадает с расширением лимфатического русла в начале грудного протока в виде цистерны, очень напоминает первый сегмент четковидной цистерны грудного протока или его начало под первым клапаном при простом слиянии поясничных стволов, но в действительности является предклапанным сегментом эфферентного лимфатического сосуда или, точнее, аксиальным синусом собственного межклапанного сегмента ЛУ. Большая часть этого нодального сегмента, помимо его аксиального синуса, расчленена лимфоидной тканью на сеть лимфатических синусов, главным образом промежуточных. Скорее всего именно сеть синусов ЛУ как полость емкостного лимфангиона лимфоидного типа, в особенности его расширение – воротный синус, соответствует цистерне в начале грудного протока. Первые лимфангионы эфферентного лимфатического сосуда ЛУ могут быть расценены как гомологи либо сегментов четковидной цистерны грудного протока, следующих за ее же первым, эквинодальным сегментом, либо первых лимфангионов грудного протока, расположенных над ампуловидной цистерной. О сходстве цистерны грудного протока и ЛУ как вариантов сложного, многоклапанного по строению и емкостного (крупная полость) по функции лимфангиона я писал давно и неоднократно. Я обращал внимание на то, что ограниченные включения лимфоидной ткани обнаруживаются в перегородках (
инвагинациях) цистерны грудного протока у белой крысы – сходным образом происходит закладка ЛУ [8, 9].
Лимфатическая система
Лимфатическая система – важная часть сердечно-сосудистой системы человека и дополняет её.
В отличие от кровеносной системы, лимфатическая система не имеет своего насоса и открыта. Лимфа, циркулирующая в ней, движется медленно и под небольшим давлением. Лимфа – жидкость, постоянно образующаяся путём дренажа межклеточной жидкости в лимфатические капилляры.
В структуру лимфатической системы входят:
• лимфатические капилляры
• лимфатические сосуды
• лимфатические узлы
• лимфатические стволы и протоки
Из капилляров лимфа поступает в лимфатические сосуды, а затем в протоки и стволы: слева в грудной проток (самый большой проток), левый яремный и левый подключичный стволы; справа в правый лимфатический проток, правый яремный и правый подключичный стволы. Протоки и стволы впадают в крупные вены шеи, а затем в верхнюю полую вену. Таким путем лимфа переносится из межтканевых пространств обратно в кровь.
Лимфатические сосуды проходят через лимфатические узлы. Они объединены в несколько групп и располагаются по ходу сосудов. Множество приносящих сосудов несут лимфу в узел, а вытекает она оттуда только по одному или двум выносящим сосудам. Лимфатические узлы представляют собой небольшие образования округлой, овальной, бобовидной, реже лентовидной формы до 2 см длиной. Здесь лимфа отфильтровывается, инородные включения отделяются и уничтожаются, и здесь же вырабатываются лимфоциты для борьбы с инфекцией. Лимфатические узлы, выполняющие барьерную и иммунную роль.
Основные функции лимфатической системы:
• Транспортная функция – проведение лимфы, продуктов обмена от тканей в венозное русло.
• Дренажная функция – возвращение белков, воды, солей, токсинов и метаболитов из тканей в кровь. Выведение жидкости, гноя, выпота из раны, полостей. Стабильность работы „капиллярного лимфатического насоса”
• Лимфоцитопоэз, кроветворная функция – образование, созревания, дифференцировка лимфоцитов, участвующих в иммунных реакциях.
• Иммунная, защитная функции – формирование иммунной защиты организма, обезвреживание, попадающих в организм инородных частиц, бактерий, вирусов, грибов, простейших. фильтрация от примесей, опухолевых частиц и клеток.
Любой сбой или закупорка лимфатических сосудов или узлов влечет за собой опухоль или отек тканей, возникают лимфадениты, рожистые воспаления, лимфостаз. Специалисты не без оснований полагают, что лимфа могла бы рассказать о том, о чем кровь «умалчивает», потому что многие продукты жизнедеятельности клеток сначала поступают в лимфу, а затем уже в кровь.
Если в борьбе со многими болезнями нам могут помочь большинство врачей, то диагностировать и лечить нарушения в лимфатической системе могут только отдельные врачи – лимфологи.
По статистике самих медиков, в СНГ – есть только единицы лимфологов – специалистов по лимфатической системе.
Лимфологи говорят: Ваше здоровье – это чистота вашей лимфатической системы!
Будьте здоровы и счастливы!
структурные и функциональные особенности лимфатических сосудов в ЦНС
Одним из свойств центральной нервной системы является отсутствие классической системы лимфатических дренажей. И хотя в настоящее время принято считать, что центральная нервная система подвергается постоянному иммунному надзору, осуществляемому в пространстве твердых мозговых оболочек, механизмы, регулирующие вход и выход иммунных клеток из ЦНС, всё ещё остаются плохо изученными. В поисках шлюзов для входа и выхода Т- клеток из мозговых оболочек, мы обнаружили функциональные лимфатические сосуды, пронизывающие синусы твердой мозговой оболочки. Эти структуры имеют все молекулярные метки лимфатических эндотелиальных клеток, способны переносить как жидкости, так и клетки иммунной системы из спинномозговой жидкости, и соединены с глубокими шейными лимфатическими узлами. Уникальное расположение этих сосудов, возможно, препятствовало их открытию вплоть до сегодняшнего дня, тем самым подтверждая, в некотором роде, давнишнюю концепцию отсутствия лимфатических сосудов в центральной нервной системе. Открытие лимфатической системы в ЦНС может потребовать переоценки основных гипотез в нейроиммунологии и проливает новый свет на этиологию нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний, связанных с дисфункцией иммунной системы.
Стремясь определить маршруты, ответственные за рециркуляцию глубинных иммунных клеток, мы исследовали менингеальные пространства и клетки, заполняющие эти пространства. Во-первых, был изготовлен препарат оболочек головного мозга мыши (Рис. 1А), который был окрашен иммуногистохимическим методом в поисках эндотелиальных клеток (Расширенные данные, рис. 1А), Т-клеток (рис. 1Б) и клеток, экспрессирующих основной комплекс гистосовместимости II (MHCII) (Расширенные данные, рис. 1Б). Маркировка этих клеток показала ограниченное распределение иммунных клеток по менингеальным пространствам, с высокой концентрацией клеток, найденных в непосредственной близости от пазух твердой мозговой оболочки (рис.1В. Расширенные данные рис. 1Б-Г)
Синусы твердой мозговой оболочки направляют кровь, как из внутренних, так и из внешних мозговых вен, во внутренние яремные вены. Была определена точная локализация Т-лимфоцитов вокруг синусов, с целью исключить возможность артефактов, вызванных неполной внутрисердечной перфузией. Коронарные срезы твердой мозговой оболочки (рис. 1В, Г) были окрашены на CD3e (Т-клетки) и CD31 (эндотелиальные клетки). Действительно, подавляющее большинство Т-лимфоцитов в районе синусов находилось вне просвета. (Рис. 1Д). Чтобы подтвердить этот вывод, мышам вводили внутривенно DyLight 488 с лектином (прим. – флуоресцентный краситель, цвет зеленый) или флуоресцентные анти-CD45 антитела до эвтаназии, и внепросветная локализация была подтверждена (Расширенные данные, рис.Д,Е), также был произведен количественный учет (рис. 1Е). Неожиданно, часть Т-клеток (и, MHCII-экспрессирующих клеток) оказалась линейно выстроенной поблизости к CD31-экспрессирующим структурам вдоль синусов (только несколько клеток были замечены в менингеальных сосудах похожего диаметра), что предполагает уникальную функцию этих околосинусовых сосудов(рис. 1Ж-И).
В дополнение к сердечно-сосудистой системе, лимфатические сосуды представляют собой отдельную и важную сосудистую сеть в организме. Воодушевленные нашими наблюдениями, мы протестировали околосинусовые сосуды на предмет маркеров, связанных с лимфатическими эндотелиальными клетками (LEC). Весь объем мозговых оболочек взрослых мышей подвергся иммуноокрашиванию на LEC-маркер, LYVE-1. Были найдены два-три LYVE-1-экспрессирующих сосуда, проходящие параллельно синусам (рис. 1 Й, К).
Изображение: журнал Nature.
Далее была изучена функциональная способность менингеальных лимфатических сосудов осуществлять отток жидкости и клеток от мозговых оболочек/ спинномозговой жидкости. Взрослым мышам под анестезией одновременно вводили флуоресцин внутривенно и флуоресцентные трассирующие красители (QDot655) интрацеребровентрикулярно, а затем через истонченный череп была произведена многофотонная микроскопия. Выровненные сосуды, наполненные QDot655, но не с флуоресцином, были замечены вдоль верхнего сагиттального синуса ( Рис 3А-Г; Дополнительное Видео 3), предполагая, что не сосуды сердечно-сосудистой системы осуществляли отток спинномозговой жидкости. Этот дренаж спинномозговой жидкости в менингеальные сосуды может быть дополнением к ранее описанной фильтрации спинномозговая жидкости через паутинные грануляции (Расширенные данные, рис. 6А). Инъекцией Alexa488 с конъюгированными анти-LYVE-1 антителами интрацеребровентрикулярно пометили менингеальные лимфатические сосуды (. Расширенные данные, рис 6 Б,В; Дополнительное Видео 4). Кроме того, ко-инъекция QDot655 и Alexa488 с конъюгированными анти-LYVE-1 антителами интрацеребровентрикулярно показала, что менингеальные лимфатические сосуды были действительно наполнены QDot655, и, таким образом, осуществляли отток спинномозговой жидкости (рис. 3 Д). Визуализация заполненных QDot655 лимфатических сосудов показала более медленный поток, но схожий в направлении поток в менингеальных лимфатических сосудах по сравнению с соседними кровеносными сосудами (Дополнительное Видео 5), подобно тому, что наблюдалось за пределами центральной нервной системы.
Изображение: журнал Nature.
Классические лимфатические сосуды, в дополнение к дренированию интерстициальной жидкости, позволяют клеткам путешествовать из тканей к лимфатическим узлам. Поэтому мы исследовали, способны ли менингеальные лимфатические сосуды переносить лейкоциты. Иммуногистохимический анализ оболочек показал, что 24% всех Т-клеток и 12% всех клеток MHCII (клетки, несущие комплекс гистосовместимости II) были найдены в просвете этих сосудов (Рис. 3Е, Расширенные данные, рис 7А,Б). Кроме того, CD11c+ клетки и B220+ клетки были также найдены в менингеальных лимфатических сосудах юных мышей (Расширенные данные, рис. 7В-Е).
Резекция глубоких шейных лимфоузлов, находящихся под влиянием Т-клеточных компартментов мозговых оболочек, привела к повышению количества менингеальных Т-клеток (Расширенные данные, рис. 9 А-Д). Причиной этому, предположительно, может быть невозможность дренажа Т-клеток из менингеальных пространств, что соответствует положению о прямой связи между мозговыми оболочками и глубокими шейными лимфоузлами. Для того, чтобы более наглядно продемонстрировать эту связь, мы лигировали лимфатические сосуды, которые дренируют глубокие шейные лимфоузлы (Расширенные данные, рис. 9 Е), и ввели мышам синий краситель Эванса интрацеребровентрикулярно. Никаких скоплений красителя в глубоких шейных лимфоузлах у лигированных мышей обнаружено не было, в то время как в группе контроля результат был противоположным (Расширенные данные рис. 9 Ж). Более того, наблюдалось увеличение диаметра менингеальных лимфатических сосудов (рис.3 З,И; Расширенные данные рис.9 З), сходное с лимфатическими отеками, наблюдаемыми в периферических тканях. Эти результаты подтверждают предположение о физической связи между менингеальными лимфатическими сосудами и глубокими шейными лимфоузлами.
Пути дренажа спинномозговой жидкости в периферию интересовали ученых в течение десятилетий. Результатом стало описание нескольких путей выхода спинномозговой жидкости из ЦНС. Недавно обнаруженные менингеальные лимфатические сосуды являются новым путем дренажа спинномозговой жидкости, и представляют собой более традиционный путь выхода иммунных клеток за пределы ЦНС. Таким образом, пути, описанные нами, могут быть вторым шагом в системе дренажа жидкости из мозговой паренхимы на периферию – после того, как она дренировалась в спинномозговую жидкость с помощью недавно обнаруженной глимфатической системы (Расширенные данные, рис. 10).
Наличие в ЦНС функционирующей классической лимфатической системы означает необходимость переосмысления всех существующих догм об устойчивости и иммунных привилегиях головного мозга. В свою очередь, дисфункция менингеальных лимфатических сосудов может быть основной причиной многочисленных неврологических заболеваний, где «основным игроком» является измененная иммунная система – рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и некоторых форм лимфедемы.
Изображение: журнал Nature
Методы
Статистические методы для предопределения объема выборки не использовались.
Животные
Особи мужского и женского пола C57Bl/6, NOD.Cd11c-YFP и Prox1tdT были приобретены в Jackson Laboratories, и содержались в комнатах с контролируемыми температурой и влажностью, а также со световым режимом 1212 ч (свет включался в 7 утра). Вся порода содержалась в идентичных условиях. Все процедуры, проводимые с животными, осуществлялись в соответствии с нормами по уходу и использованию животных соответствующего комитета Виргинского университета. В этом исследовании участвовали только взрослые особи (возрастом 8-10 недель). Размер выборки был установлен в соответствии с похожими, ранее опубликованными экспериментами. В каждую экспериментальную группу выбирались животные из разных клеток для обеспечения метода слепого отбора.
Человеческие образцы
Образцы твердой мозговой оболочки вместе с верхним сагиттальным синусом были получены с кафедры Патологии и Нейрохирургии Виргинского университета. Все образцы получены после вскрытия пациентов, которые дали свое согласия на использование их тела для исследовательских и научных целей без каких-либо ограничений. Образцы были зафиксированы 10% раствором формалина, и в дальнейшем хранились в этих же условиях.
Иммуногистохимическое исследование оболочек мозга
Эвтаназия мышей была проведена путем интраперитонеального введения эутазола и перфузирования 0,1 М фосфатным буфером (PBS) в течение 5 минут. Кожа головы была удалена, а мышцы отделены от костей. После удаления нижней челюсти и частей черепа выше верхней челюсти, с помощью хирургических ножниц был удален свод черепа. Мозговые оболочки, все еще связанные с черепом, были зафиксированы PBS с 2% параформальдегидом (PFA) в течение 24 ч при температуре 4 о или раствором этанола и ацетона в соотношении 1:1 при температуре 20 о в течение 20 мин (в зависимости от антител). Далее были отделены твердая и паутинная мозговые оболочки. Для анализа мягкой мозговой оболочки мозг, изъятый из черепной коробки, замораживался, после чего криостатом изготовлялись поперечные срезы толщиной 40 мкм. Сосудистое сплетение отделяли от желудочков незафиксированного мозга, и в дальнейшем фиксировали 2% параформальдегидом в фосфатном буфере в течение 24 часов. Для приготовления корональных срезов мозговых оболочек, в синусы перед разделением вводили 100 мл матригеля. Твердую и паутинную оболочки отделяли от свода черепа, замораживали, и с помощью криостата изготовляли срезы толщиной 10 мкм, которые далее помещались в желатинизированную среду.
Для человеческих образцов, из зафиксированного формалином верхнего сагиттального синуса были изготовлены срезы толщиной 2 мм, которые в течение ночи выдерживались в фосфатном буфере с 4% параформальдегида. Затем ткани заливались реактивом ОСТ, после чего криостатом изготавливались срезы толщиной 10 мкм, которые далее помещались в желатинизированную среду. Антигенный материал получали путем инкубации срезов в натрий цитратном буфере с рН 6,0 при температуре
Анализ изображений
Изображения были получены с использованием конфокальной системы Leica TCS SP8 (Leica Microsystems) и программного обеспечения LAS AFS. Для получения изображений тотального препарата оболочек использовался объектив с десятикратным увеличением и апертурным числом 0,25. Остальные конфокальные изображения были получены с использованием объектива с увеличением х20 и апертурным числом 0,7, а также иммерсионного объектива х40 с апертурным числом 1,3. Разрешение всех изображений – 512х512 пикселей.
Количественная оценка была произведена с использованием программного обеспечения FIJI (NIH). Процентное отношение люминальных Т-клеток определялось путем подсчета количества таких клеток с люминальной локализацией в синусе. Густота определялась путем деления количества Т-лимфоцитов на площадь мозговых оболочек. Густота Prox1-положительных клеток определялась путем деления количества Prox1+ ядер на площадь лимфатических сосудов. Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism. Различные тесты, применяемые в ходе исследований, поданы в тексте описания каждого эксперимента. Резко отклоняющиеся по значению образцы были устранены путем использования критерия Граббса с уровнем значимости 0,01 (применялось только для rh-VEGF-c –эксперимента). Оценка вариативности между группами не проводилась.
Электронная микроскопия
Мозговые оболочки были отобраны за схемой, описанной выше, и зафиксированы в 2,5% глутаральдегиде, 2% параформальдегиде в 0,1 М какодиловокислом натриевом буфере с рН 7,4. Затем – снова зафиксированы в 2 % тетрахлориде осмия в 0,1 М какодиловокислом натриевом буфере с 0,15 % ферроцианида калия. После ополаскивания в буфере, ткань была обезвожена путем пропускания через растворы этанола разных концентраций, а затем – через раствор оксида пропилена. Следующий шаг – инфильтрация, заливка эпоксидной смолой и полимеризация в течение ночи при температуре 70 о С. Срезы толщиной 0,5 мкм были окрашены толуидиновым синим для исследования световой микроскопией. Ультратонкие срезы – 80 нм – были изготовлены с использованием Tecnai TF20 TEM с камерой AMT XR41 (Расширенные данные, Рис. 5И) или Tecnai F20 TEM с камерой UltraScanCCD.
Многофотонная микроскопия
Маркировка васкулярных компартментов
Для того, чтобы изучить аблюминальную локализацию синусальных Т-клеток, мышам интравенозно ввели 10 мг FITC-конъюгированных анти-CD45 антител или контрольных изотипов за 1 ч до эвтаназии. Чтобы установить, что менингеальные лимфатические сосуды не являются частью сердечно-сосудистой системы, мышам было введено 100 мл DyLight 488 Lycopersicon Esculentum Lectin за 5 минут до эвтаназии.
Активация VEGFR3 in vivo
Мышам интрацеребровентрикулярно было введено 4 мг rh-VEGF-c (Cys156Ser, R&D Systems) или PBS. Мозговые оболочки были отобраны через 7 или через 14 дней после инъекции.
Введение синего красителя Эванса и его определение
Анализ мозговых оболочек методом проточной цитометрии
Резекция глубоких шейных лимфоузлов, лигирование и проведение «ложных операций»
Расширенные данные
Изображение: журнал Nature
А) Изображение окрашивания CD31 тотального препарата мозговых оболочек (масштабная линейка 2000 мкм) Б) Изображение Т-клеток (окрашены CD3e, обозначены стрелками) в твердой паутинной и мягкой мозговых оболочках, а также в синусах твердой мозговой оболочки и в сосудистом сплетении (масштабная линейка 70 мкм) В) Количественное соотношение густоты Т-клеток в различных менингеальных компартментах (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), по 6 животных в каждой группе из 2х независимых экспериментов, Р= 0, 001; критерий Крускала-Уоллиса, тест Данна) Г) Количественное соотношение MHCII-экспрессирующих клеток в различных менингеальных компартментах (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), по 6 животных в каждой группе из 2х независимых экспериментов, Р= 0, 001; критерий Крускала-Уоллиса, тест Данна) Д) Взрослым мышам интравенозно ввели 100 мл DyLight 488 с лектином за 5 мин перед эвтаназией для обеспечения маркировки сердечно-сосудистой системы. Мозговые оболочки были отобраны и окрашены анти- CD3e. На изображении- локализация Т-клеток внутри (белые стрелки) и снаружи синуса – желтые стрелки (2 мыши, масштабная линейка 70 мкм) Е) Взрослым мышам ввели 10 мкг FITC-конъюгированных анти- CD45 антител или FITC-конъюгированных изотипных антител. Мозговые оболочки были отобраны через час после инъекции и окрашены анти- CD3e. На изображении показано иммуномаркировка CD3e вокруг синусов твердой мозговой оболочки. CD45-положительные клетки не располагаются рядом с CD3e1-клетками, что предполагает аблюминальную локализацию последних (2 мыши в каждой группе, масштабная линейка- 20 мкм) Ж) 3D-реконструкция локализации лимфатических сосудов вокруг верхнего сагиттального синуса. Взрослым мышам интравенозно ввели 100 мл DyLight 488с лектином за 5 минут до эвтаназии для окрашивания сердечно-сосудистой системы. Мозговые оболочки были отобраны и маркированы анти-Lyve-1. Отсутствие окрашивания лектином в Lyve-1-положительных менингеальных лимфатических сосудах предполагает отсутствие связи между этими сосудами и сердечно-сосудистой системой (3 мыши, масштабные линейки: слева – 50 мкм, справа – 120 мкм)
Изображение: журнал Nature
А) Изображение маркировки Prox1 в менингеальных Lyve-1-экспрессирующих сосудах (3 мыши, масштабная линейка 10 мкм) Б) Схематическое изображение тотального рассечения диафрагмы В) Характеристика специфичности антител подопланина. Изображение диафрагмы, окрашенной анти- Lyve-1 и анти-подопланином (ві), контрольными изотипом (віі) или заранее инкубированным анти-подопланином, насыщенным рекомбинантным подопланиновым белком (вііi, масштабная линейка 20 мкм) Г) Характеристика специфичности антител VEGFR3. Изображение диафрагмы и твердой мозговой оболочки, окрашенных анти- Lyve-1 и анти- VEGFR3 (гi), вторичными антителами (гii) или заранее инкубированным анти- VEGFR3 насыщенным рекомбинантным белком VEGFR3 (гiii, масштабная линейка 20 мкм) Д) Количественное соотношение числа Prox1+ клеток на каждый квадратный миллиметр лимфатического сосуда (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), по 4 животных в каждой группе)
Изображение: журнал Nature
А) Была применена стратегия синхронизации для идентификации лимфатических эндотелиальных клеток (CD31+, подопланин+). Лимфатические эндотелиальные клетки определяются как живые, CD45- и CD31+, подопланин+, клетки. Б) Точечные диаграммы для лимфатических эндотелиальных клеток диафрагмы,кожи и твердой мозговой оболочки взрослых мышей.
Изображение: журнал Nature
А) Изображение фиксированного в формалине коронального среза верхнего сагиттального синуса человека Б, В) Изображения коронального среза верхнего сагиттального синуса человека, окрашенного Lyve-1 (масштабная линейка 100 мкм). Выделенная в «В» область отображает наличие Lyve-1-экспрессирующих макрофагов в мозговых оболочках человека, точно так же, как это наблюдалось и у мышей. Г) Изображения коронального среза верхнего сагиттального синуса человека, окрашенного Lyve-1 и CD68. Обратите внимание на отсутствие положительного результата на CD68 в Lyve-1-положительных структурах (масштабная линейка 50 мкм) Д) Изображения коронального среза верхнего сагиттального синуса человека, окрашенного подопланином и Lyve-1 (масштабная линейка 50 мкм).
Изображение: журнал Nature
Изображение: журнал Nature
Изображение: журнал Nature
Изображение: журнал Nature
А-В) Взрослым мышам интрацеребровентрикулярно ввели 5 мл 10% синего красителя Эванса. Мозговые оболочки были отобраны спустя 30 минут после инъекции. Локализация красителя определялась конфокальной микроскопией. А) – Локализация красителя в синусе и менингеальных лимфатических сосудах. ( 9 мышей, масштабная линейка 40 мкм). Б) – Отображение флуоресцентной интенсивности красителя Эванса и Lyve-1 на поперечном срезе участка, представленного в «А». В) – Процентное соотношение средней интенсивности красителя Эванса в синусе, лимфатических сосудах и мозговых оболочках взрослой мыши (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), проанализировано 16 участков от 4 животных, Р= 0, 01; критерий Крускала-Уоллиса, тест Данна) Г, Д) Взрослым мышам интраназально ввели 5 мл 10% синего красителя Эванса. Показано успешное введение в слизистую носовой полости (Г) и отсутствие скопления красителя в глубоких шейных лимфоузлах (Д) спустя 30 минут после инъекции.
Изображение: журнал Nature
Изображение: журнал Nature
Схематическое отображение связи между глимфатической системой, ответственной за отвод интерстициальной жидкости из паренхимы ЦНС в спинномозговую жидкость, и обнаруженной нами системой менингеальных лимфатических сосудов.
Оригинал статьи
Перевод: Татьяна Харьковская, Татьяна Юзвинкевич